Исследование агрегации тромбоцитов. Диагностическое значение агрегатограмм. Статья

Мы регулярно проводим бесплатные вебинары для врачей по узкоспециализированным темам (гематология, гемостазиология, особенности лабораторной диагностики различных заболеваний, редкие заболевания системы гемостаза и т.д.). Для того, чтобы своевременно узнавать о вебинарах, присоединяйтесь к нашему профессиональному сообществу в Телеграм.

Текст выступления на Всероссийской научно-практической конференций «Всемирный день тромбоза в России» 13.10.2023, организованной Национальной ассоциацией по тромбозу и гемостазу

Видеозапись выступления здесь.

Автор – главный врач НКЦПГ им. А.А. Шмида, к.м.н, врач высшей квалификационной категории Альтшулер Б.Ю.

Презентация к статье здесь.

Анализы в НКЦПГ им. А.А. Шмидта: Оптическая агрегатометрия, Потоковая динамическая агрегатометрия, Тромбоэластография (ТЭГ)

Содержание:

1.      Методы исследования агрегации тромбоцитов 

2.      Оптическая агрегатометрия

3.      Импедансная агрегатометрия

4.      Потоковая (динамическая) агрегатометрия

5.      Тромбоэластометрия

 

Методы исследования агрегации тромбоцитов 

Какие методы для исследования агрегации тромбоцитов применяются в клинической практике?21-11-1.png

Это оптическая агрегатометрия по Борну, импедансная агрегатометрия, потоковая, она же динамическая агрегатометрия и тромбоэластометрия.

Ранее для исследования агрегантной активности тромбоцитов использовались визуальная оценка на предметном стекле, пробирочный метод и т.н. гемолизат-агрегационный тест. Косвенные указания на изменение агрегантной активности тромбоцитов иногда обнаруживаются при микроскопии мазка крови. В нем могут наблюдаются тромбоцитарные скопления и агрегаты, что наводит на предположение о гиперагрегации тромбоцитов.

Оптическая агрегатометрия 

Начнем с «золотого стандарта» - оптической агрегатометрии. Метод основан на смешении богатой тромбоцитами плазмы крови с индукторами агрегации. Ими могут быть АДФ, адреналин, коллаген, арахидоновая кислота, тромбин и ристомицин (ристоцетин). Используются индукторы в разных концентрациях, что имеет важное диагностическое значение, о чем будет указано ниже.21-11-2.jpg

По мере образования агрегатов, происходит «просветление» исследуемого образца, потому что крупные агрегаты меньше рассеивают свет, чем отдельные тромбоциты. Это фиксируется оптической системой агрегометра. Таким образом, агрегатограмма отражает не помутнение среды за счет накопления агрегатов, а, наоборот, ее просветление. Полное просветление исследуемого образа условно принимается за 100%.

Богатую тромбоцитами плазму получают центрифугированием крови с низкой скоростью вращения центрифуги. Режим центрифугирования (время и скорость вращения) подбирается индивидуально, в зависимости от концентрации тромбоцитов в крови пациента. В итоге концентрация тромбоцитов в плазме для исследования должна быть одинаковой независимо от исходной концентрации тромбоцитов в образце крови.

В случае выраженного тромбоцитоза это достигается разведением богатой тромбоцитами плазмы бестромбоцитарной плазмой того же пациента. При тромбоцитопении зачастую приходится отказываться от центрифугирования крови, получая плазму методом отстаивания. Правильный выбор режима центрифугирования очень важен, поскольку низкая концентрация тромбоцитов ведет к занижению амплитудных параметров, что может ошибочно интерпретироваться как гипоагрегация.21-11-3.png

В связи с этим исследование крови методом оптической агрегатометрии нежелательно при выраженной тромбоцитопении. Даже отказ от центрифугирования и получение богатой тромбоцитами плазмы методом отстаивания не позволяют в этом случае добиться их необходимой концентрации в исследуемом образце. Как следствие низкие амплитудные значения делают интерпретацию результатов затруднительной или бессмысленной. В таких случаях для исследования функции тромбоцитов вместо оптической агрегатометрии мы рекомендуем использовать потоковую динамическую агрегатометрию.

Результатом исследования является агрегатограмма с цифровыми параметрами. Для каждого агрегометра характерен свой вид агрегатограммы. Общие закономерности есть, но различий не меньше. В нашей лаборатории для агрегатометрии мы используем автоматический анализатор CS-2000i японского производителя Sysmex.

Для каждой агрегатограммы важны лаг-фаза (задержка от запуска реакции до начала формирования агрегатов), амплитуда, скорость развития агрегации и дезагрегации. В зависимости от этого говорят о завершенной и незавершенной, обратимой и необратимой агрегации.

Также агрегация может быть одноволновой и двухволновой. Первая волна агрегации отражает воздействие индуктора в составе реактива. Вторая волна характеризует высвобождение из тромбоцитарных пулов хранения эндогенных индукторов агрегации, поддерживающих ее и обеспечивающих необратимость.

Нужно помнить, что амплитуда агрегатограммы отражает прежде всего концентрацию тромбоцитов в исследуемом образце, а не только их агрегантную активность.

Для правильной оценки агрегантной активности тромбоцитов необходимо использовать различные концентрации индукторов. Развитие агрегации с низкими концентрациями индуктора, с которыми в нормальных условиях агрегация не развивается или оказывается низкоамплитудной и быстро обратимой, говорит о гиперагрегации тромбоцитов. Отсутствие агрегации, ослабленная или обратимая агрегация с концентрациями индукторов, в норме вызывающими завершенную и необратимую агрегацию, напротив, показывает гипоагрегацию тромбоцитов.

АДФ, как индуктор, предпочтительнее для диагностики гиперагрегации тромбоцитов.

21-11-4.png Использование различных концентраций АДФ позволяет точно оценить агрегантную активность тромбоцитов. Адреналин, коллаген, арахидоновая кислота и ристомицин для обнаружения гиперагрегации менее пригодны.

При гипоагрегации характер агрегатограмм и диагностические возможности индукторов зависят от ее причин или антиагрегантной терапии. Сказать, что один индуктор полезнее другого для диагностики гипоагрегации – нельзя.

21-11-5.png

Отдельный вид оптической агрегатометрии – это исследование спонтанной агрегации тромбоцитов. При этом индуктор не используется. На тромбоциты действует только перемешивание, имитирующее нарушение упорядоченного тока крови. Известно, что такие нарушения гемодинамики сильно активируют тромбоциты. Обратите внимание, что исследование спонтанной агрегации не может заменить собой индуцированную агрегатометрию, поскольку in vivo тромбоциты активируются прежде всего химически. Но спонтанная агрегация тромбоцитов, которой в норме не должно наблюдаться, особенно быстро развивающаяся, высокоамплитудная и необратимая – это важный диагностический критерий. Как выглядят результаты оптической агрегатометрии в норме и на фоне различных нарушений показано в статье на нашем сайте «Лабораторная диагностика сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Исследование агрегации тромбоцитов».

Какие из этого следуют выводы:

Во-первых, интерпретация агрегатограмм требует хорошего знания предмета и большого опыта работы, желательно, с разными агрегометрами, или заключения специалиста-гемостазиолога.

Во-вторых, исследование агрегации тромбоцитов исключительно по значениям амплитуды без агрегатограмм – абсолютно бессмысленно. Потому что считывание результата в фиксированное время не учитывает характер агрегации. В зависимости от концентрации тромбоцитов, лаг-фазы, скорости развития агрегации и дезагрегации ошибка может составлять десятки процентов. Результат исследования в числовой форме без агрегатограммы дает диагностической информации не больше, чем, к примеру, один-единственный снимок из видео МРТ-исследования. Если вы не видите саму агрегатограмму – откладывайте бланк такого анализа в сторону.

Импедансная агрегатометрия 

Импедансная агергатометрия основана на измерении электрического сопротивления. Исследуемым материалом может быть богатая тромбоцитами плазма крови или цельная кровь, что является преимуществом метода. Как и при оптической агрегатометрии, исследуемый образец смешивается с индуктором. В него погружаются электроды, на которых по мере формирования оседают тромбоцитарные агрегаты, что и меняет электропроводность.

К сожалению, преимущества импедансной агрегатометрии перекрываются ее недостатками. Это необходимость тщательного ухода за электродами, низкая воспроизводимость и чувствительность по сравнению с оптической агрегатометрией. Кроме того, импедансная агрегатометрия не предусматривает автоматизации, что снижает производительность оборудования и лаборатории. На сегодня импедансная агрегатометрия у нас в стране в лабораторной диагностике практически не используется.

Потоковая (динамическая) агрегатометрия 

Для потоковой или динамической агрегатометрии используется цельная кровь. Само исследование, как следует из названия, проводится в потоке, в условиях гемодинамического сдвига. Кровь пропускается через микроотверстие со скоростью и под давлением, имитируя условия, в которых находятся тромбоциты в сосудистом русле. Окклюзия отверстия происходит по мере формирования в нем под действием индукторов тромбоцитарной «пробки», что регистрируется по изменению перфузионного давления. Это максимально приближает поточную агрегатометрию к физиологическим условиям. Ее технология учитывает все этапы межклеточных взаимодействий, активации, адгезии и агрегации тромбоцитов.

21-11-6.png

Важное преимущество потоковой агрегатометрии в том, что результат зависит не только от свойств тромбоцитов, но также от их концентрации и реологических свойств крови.

В отличие от оптической или импедансной, потоковая агрегатометрия дает врачу количественную и визуально понятную оценку замедления или активации сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Анализ автоматизирован, для чего используются одноразовые картриджи. Малое время исследования позволяет быстро получить результат, оценить риск возникновения кровотечений или тромбозов.  

Как выглядят результаты динамической агрегатометрии – показано в статье на нашем сайте «Лабораторная диагностика сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Исследование агрегации тромбоцитов».

Тромбоэластометрия 

Последний метод, который стоит упомянуть – это тромбоэластометрия. Тромбоэластометрия чувствительна в первую очередь к количеству тромбоцитов. При нормальном количестве тромбоцитов заподозрить этим методом изменение их агрегантной активности трудно.

Без использования индукторов агрегации изменения тромбоэластограммы наблюдаются только при выраженном, тотальном снижении концентрации тромбоцитов.

Использование индукторов значительно повышает чувствительность тромбоэластометрии. Однако она все равно недостаточна, чтобы конкурировать с оптической или поточной агрегатометрией.

Текст выступления на Всероссийской научно-практической конференций «Всемирный день тромбоза в России» 13.10.2023, организованной Национальной ассоциацией по тромбозу и гемостазу

Видеозапись выступления здесь.

Автор – главный врач НКЦПГ им. А.А. Шмида, к.м.н, врач высшей квалификационной категории Альтшулер Б.Ю.

Презентация к статье здесь.

Анализы в НКЦПГ им. А.А. Шмидта: Оптическая агрегатометрия, Потоковая динамическая агрегатометрия, Тромбоэластография (ТЭГ)

Содержание:

1.      Методы исследования агрегации тромбоцитов 

2.      Оптическая агрегатометрия

3.      Импедансная агрегатометрия

4.      Потоковая (динамическая) агрегатометрия

5.      Тромбоэластометрия

 

Методы исследования агрегации тромбоцитов 

Какие методы для исследования агрегации тромбоцитов применяются в клинической практике?21-11-1.png

Это оптическая агрегатометрия по Борну, импедансная агрегатометрия, потоковая, она же динамическая агрегатометрия и тромбоэластометрия.

Ранее для исследования агрегантной активности тромбоцитов использовались визуальная оценка на предметном стекле, пробирочный метод и т.н. гемолизат-агрегационный тест. Косвенные указания на изменение агрегантной активности тромбоцитов иногда обнаруживаются при микроскопии мазка крови. В нем могут наблюдаются тромбоцитарные скопления и агрегаты, что наводит на предположение о гиперагрегации тромбоцитов.

Оптическая агрегатометрия 

Начнем с «золотого стандарта» - оптической агрегатометрии. Метод основан на смешении богатой тромбоцитами плазмы крови с индукторами агрегации. Ими могут быть АДФ, адреналин, коллаген, арахидоновая кислота, тромбин и ристомицин (ристоцетин). Используются индукторы в разных концентрациях, что имеет важное диагностическое значение, о чем будет указано ниже.21-11-2.jpg

По мере образования агрегатов, происходит «просветление» исследуемого образца, потому что крупные агрегаты меньше рассеивают свет, чем отдельные тромбоциты. Это фиксируется оптической системой агрегометра. Таким образом, агрегатограмма отражает не помутнение среды за счет накопления агрегатов, а, наоборот, ее просветление. Полное просветление исследуемого образа условно принимается за 100%.

Богатую тромбоцитами плазму получают центрифугированием крови с низкой скоростью вращения центрифуги. Режим центрифугирования (время и скорость вращения) подбирается индивидуально, в зависимости от концентрации тромбоцитов в крови пациента. В итоге концентрация тромбоцитов в плазме для исследования должна быть одинаковой независимо от исходной концентрации тромбоцитов в образце крови.

В случае выраженного тромбоцитоза это достигается разведением богатой тромбоцитами плазмы бестромбоцитарной плазмой того же пациента. При тромбоцитопении зачастую приходится отказываться от центрифугирования крови, получая плазму методом отстаивания. Правильный выбор режима центрифугирования очень важен, поскольку низкая концентрация тромбоцитов ведет к занижению амплитудных параметров, что может ошибочно интерпретироваться как гипоагрегация.21-11-3.png

В связи с этим исследование крови методом оптической агрегатометрии нежелательно при выраженной тромбоцитопении. Даже отказ от центрифугирования и получение богатой тромбоцитами плазмы методом отстаивания не позволяют в этом случае добиться их необходимой концентрации в исследуемом образце. Как следствие низкие амплитудные значения делают интерпретацию результатов затруднительной или бессмысленной. В таких случаях для исследования функции тромбоцитов вместо оптической агрегатометрии мы рекомендуем использовать потоковую динамическую агрегатометрию.

Результатом исследования является агрегатограмма с цифровыми параметрами. Для каждого агрегометра характерен свой вид агрегатограммы. Общие закономерности есть, но различий не меньше. В нашей лаборатории для агрегатометрии мы используем автоматический анализатор CS-2000i японского производителя Sysmex.

Для каждой агрегатограммы важны лаг-фаза (задержка от запуска реакции до начала формирования агрегатов), амплитуда, скорость развития агрегации и дезагрегации. В зависимости от этого говорят о завершенной и незавершенной, обратимой и необратимой агрегации.

Также агрегация может быть одноволновой и двухволновой. Первая волна агрегации отражает воздействие индуктора в составе реактива. Вторая волна характеризует высвобождение из тромбоцитарных пулов хранения эндогенных индукторов агрегации, поддерживающих ее и обеспечивающих необратимость.

Нужно помнить, что амплитуда агрегатограммы отражает прежде всего концентрацию тромбоцитов в исследуемом образце, а не только их агрегантную активность.

Для правильной оценки агрегантной активности тромбоцитов необходимо использовать различные концентрации индукторов. Развитие агрегации с низкими концентрациями индуктора, с которыми в нормальных условиях агрегация не развивается или оказывается низкоамплитудной и быстро обратимой, говорит о гиперагрегации тромбоцитов. Отсутствие агрегации, ослабленная или обратимая агрегация с концентрациями индукторов, в норме вызывающими завершенную и необратимую агрегацию, напротив, показывает гипоагрегацию тромбоцитов.

АДФ, как индуктор, предпочтительнее для диагностики гиперагрегации тромбоцитов.

21-11-4.png Использование различных концентраций АДФ позволяет точно оценить агрегантную активность тромбоцитов. Адреналин, коллаген, арахидоновая кислота и ристомицин для обнаружения гиперагрегации менее пригодны.

При гипоагрегации характер агрегатограмм и диагностические возможности индукторов зависят от ее причин или антиагрегантной терапии. Сказать, что один индуктор полезнее другого для диагностики гипоагрегации – нельзя.

21-11-5.png

Отдельный вид оптической агрегатометрии – это исследование спонтанной агрегации тромбоцитов. При этом индуктор не используется. На тромбоциты действует только перемешивание, имитирующее нарушение упорядоченного тока крови. Известно, что такие нарушения гемодинамики сильно активируют тромбоциты. Обратите внимание, что исследование спонтанной агрегации не может заменить собой индуцированную агрегатометрию, поскольку in vivo тромбоциты активируются прежде всего химически. Но спонтанная агрегация тромбоцитов, которой в норме не должно наблюдаться, особенно быстро развивающаяся, высокоамплитудная и необратимая – это важный диагностический критерий. Как выглядят результаты оптической агрегатометрии в норме и на фоне различных нарушений показано в статье на нашем сайте «Лабораторная диагностика сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Исследование агрегации тромбоцитов».

Какие из этого следуют выводы:

Во-первых, интерпретация агрегатограмм требует хорошего знания предмета и большого опыта работы, желательно, с разными агрегометрами, или заключения специалиста-гемостазиолога.

Во-вторых, исследование агрегации тромбоцитов исключительно по значениям амплитуды без агрегатограмм – абсолютно бессмысленно. Потому что считывание результата в фиксированное время не учитывает характер агрегации. В зависимости от концентрации тромбоцитов, лаг-фазы, скорости развития агрегации и дезагрегации ошибка может составлять десятки процентов. Результат исследования в числовой форме без агрегатограммы дает диагностической информации не больше, чем, к примеру, один-единственный снимок из видео МРТ-исследования. Если вы не видите саму агрегатограмму – откладывайте бланк такого анализа в сторону.

Импедансная агрегатометрия 

Импедансная агергатометрия основана на измерении электрического сопротивления. Исследуемым материалом может быть богатая тромбоцитами плазма крови или цельная кровь, что является преимуществом метода. Как и при оптической агрегатометрии, исследуемый образец смешивается с индуктором. В него погружаются электроды, на которых по мере формирования оседают тромбоцитарные агрегаты, что и меняет электропроводность.

К сожалению, преимущества импедансной агрегатометрии перекрываются ее недостатками. Это необходимость тщательного ухода за электродами, низкая воспроизводимость и чувствительность по сравнению с оптической агрегатометрией. Кроме того, импедансная агрегатометрия не предусматривает автоматизации, что снижает производительность оборудования и лаборатории. На сегодня импедансная агрегатометрия у нас в стране в лабораторной диагностике практически не используется.

Потоковая (динамическая) агрегатометрия 

Для потоковой или динамической агрегатометрии используется цельная кровь. Само исследование, как следует из названия, проводится в потоке, в условиях гемодинамического сдвига. Кровь пропускается через микроотверстие со скоростью и под давлением, имитируя условия, в которых находятся тромбоциты в сосудистом русле. Окклюзия отверстия происходит по мере формирования в нем под действием индукторов тромбоцитарной «пробки», что регистрируется по изменению перфузионного давления. Это максимально приближает поточную агрегатометрию к физиологическим условиям. Ее технология учитывает все этапы межклеточных взаимодействий, активации, адгезии и агрегации тромбоцитов.

21-11-6.png

Важное преимущество потоковой агрегатометрии в том, что результат зависит не только от свойств тромбоцитов, но также от их концентрации и реологических свойств крови.

В отличие от оптической или импедансной, потоковая агрегатометрия дает врачу количественную и визуально понятную оценку замедления или активации сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Анализ автоматизирован, для чего используются одноразовые картриджи. Малое время исследования позволяет быстро получить результат, оценить риск возникновения кровотечений или тромбозов.  

Как выглядят результаты динамической агрегатометрии – показано в статье на нашем сайте «Лабораторная диагностика сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Исследование агрегации тромбоцитов».

Тромбоэластометрия 

Последний метод, который стоит упомянуть – это тромбоэластометрия. Тромбоэластометрия чувствительна в первую очередь к количеству тромбоцитов. При нормальном количестве тромбоцитов заподозрить этим методом изменение их агрегантной активности трудно.

Без использования индукторов агрегации изменения тромбоэластограммы наблюдаются только при выраженном, тотальном снижении концентрации тромбоцитов.

Использование индукторов значительно повышает чувствительность тромбоэластометрии. Однако она все равно недостаточна, чтобы конкурировать с оптической или поточной агрегатометрией.