Алгоритмы и принципы диагностики гемостаза

Лекция в Федеральном научно-клиническом центре специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России 26.08.2022

Лектор - Главный врач НКЦПГ им. А.А. Шмидта, к.м.н., врач высшей квалификационной категории Альтшулер Б.Ю.

Содержание:
Вступление, общие сведения.
Обзор лабораторных методов диагностики гемостаза
Система протеина С и факторы свертывания
Исследование фибринолитической системы
D-димеры и РФМК. Маркеры АФС
Исследование сосудисто-тромбоцитарного гемостаза
Интегральные (глобальные) исследования
Плюсы и минусы различных методов исследования
В заключение

   Использованная на лекции презентация

 Аудиозапись лекции

Вступление, общие сведения

Добрый день, уважаемые коллеги!

Благодарю за возможность выступить в таком серьезном и авторитетном медицинском учреждении как ФМБА.

Свое выступление я хочу посвятить не какой-то одной патологии или методу диагностики, а исследованию гемостаза в целом. С точки зрения практической работы: на что стоит обращать внимание, какие технологии работают, а какие не работают, какие сложности и «подводные камни» существуют.

Напомню основы.

В системе гемостаза можно выделить три основных звена. Это плазменное звено, тромбоцитарное звено и стенка сосудов. Работают они вместе, но исследуются по-отдельности, хотя существуют и методы их интегральной оценки.

Выделяют два основных нарушения гемостаза: это тромбофилия, то есть повышение риска тромбоза, и геморрагический синдром или повышенный риск кровоточивости. И те, и другие могут быть как врожденными, так и приобретенными.

Тромбофилии встречаются чаще, составляя более 90% всех нарушений гемостаза. С точки зрения риска для здоровья они намного опаснее. В отличие от геморрагического синдрома, никогда не возникающего внезапно и формирующегося постепенно, тромбозы развиваются быстро, зачастую на фоне предшествующего благополучия и хорошего самочувствия. В результате ни пациент, ни врачи среагировать своевременно не успевают, имея дело уже с последствиями.

Поэтому превентивная диагностика и превентивная коррекция нарушений гемостаза так важны.

Нарушения гемостаза, в том числе серьезные, могут развиваться при самых разных заболеваниях. Также они могут вызываться и проводимой терапией. Ни один из врачей, в какой бы области медицины он не работал, не застрахован от столкновения с такими нарушениями на практике. У каждого десятого человека можно обнаружить то или иное нарушение гемостаза. И у каждого двадцатого нарушения эти столь серьезны, что требуют терапевтической коррекции. В качестве примера напомню, что только в США с их медициной, финансированием и отношением к здоровью только от ТЭЛА каждый год умирает свыше 350 тыс. человек. Это не частота встречаемости тромботических состояний или общее количество тех, у кого они диагностируются, – это количество летальных исходов и только от ТЭЛА и до пандемии COVID-19!

Обзор лабораторных методов диагностики гемостаза

Какие способы диагностики свертывающей системы крови и контроля направленной на неё терапии существуют? Они могут быть лабораторными и клиническими. Лабораторные считаются важнейшими с точки зрения объема и объективности получаемой информации.

Перед тем, как перейти собственно к лабораторным методам, хочу обратить ваше внимание на важнейший их этап. Он называется преаналитическим и касается всего, что происходит с образцами биологического материала до их поступления в лабораторию. Почему он так важен?

Дело в том, что многие компоненты свертывающей системы крови крайне нестабильны и подвержены быстрой деградации. Концентрация и активность многих из них уже через 2-3 часа после забора крови может снизиться наполовину, что значительно затрудняет их определение. Руководства по лабораторной диагностике, методические указания, ГОСТы требуют выполнения всех исследований свертывающей системы крови в течение 4-х часов после венопункции.

В связи с этим возникают вопросы к практике централизации лабораторных исследований. В ее основе лежит забор крови с последующей транспортировкой в отдаленную лабораторию и отсроченное выполнение исследований. Причина централизации лабораторных исследований только одна – стремление к удешевлению за счет снижения себестоимости. Платой за это становится принципиальная невозможность выполнения многих исследований, риск получения неправильных результатов, сомнение в их достоверности.

Какие исследования гемостаза существуют?

Их можно разделить на определение отдельных компонентов и так называемые интегральные или глобальные исследования. Интегральные исследования отличаются тем, что охватывают целые блоки и регуляторные звенья гемостаза. Существуют интегральные исследования, характеризующие и всю систему гемостаза в целом.

Также исследования можно разделить на скриниговые, дающие обзорную информацию, и углубленные, позволяющие оценить состояние гемостаза детально.

К скринингу традиционно относится определение протромбина, АЧТВ, тромбинового времени и фибриногена. Определение протромбина и АЧТВ тоже можно считать интегральными исследованиями, так как они характеризуют состояние соответственно внешнего и внутреннего путей свертывания крови.

Напомню, что внешний путь свертывания обеспечивает остановку кровотечения при повреждении тканей, нарушении целостности сосудистого русла и попадания в кровь тканевого тромбопластина. Внутренний путь свертывания обеспечивается контактной активацией факторов свертывания без повреждения сосудистой стенки.

Удлинение АЧТВ говорит о дефиците одного или нескольких факторов внутреннего пути свертывания. Укорочение АЧТВ, наоборот, свидетельствует об активизации свертывания крови по внутреннему пути, с большой вероятностью обусловленном повышенным содержанием факторов внутреннего пути. Напомню – это XII-й, XI-й, IX-й и VIII-й факторы.

Удлинение протромбинового времени говорит о замедлении свертывания крови по внешнему пути, зависящем от содержания не только самого протромбина (он же II-й фактор свертывания), но и VII-го фактора свертывания.

Также на результаты этих исследований влияет содержание V-го и Х-го факторов свертывания, лежащих на пересечении внешнего и внутреннего путей, концентрация фибриногена и стабилизирующего фибриновый сгусток XIII-го фактора.

Тромбиновое время – это скрининговый тест на полимеризацию фибрина и антикоагулянтную активность плазмы крови.

Определение протромбина, АЧТВ, тромбинового времени и фибриногена входит в базовую коагулограмму. Коагулограмма может быть и развернутой. Что может в нее входить? Во-первых, это исследование естественных антикоагулянтов, к которым относятся антитромбин-III и система протеина С.

Система протеина С и факторы свертывания

Система протеина C сложно организована, и значение имеет ее итоговый антикоагулянтный потенциал. Зависит он главным образом от концентрации самого протеина С и активирующего его кофактора – протеина S. Определение антикоагулянтного потенциала системы протеина можно рассматривать как интегральное исследование.

Что еще важно исследовать? Это резистентность Vа фактора свертывания крови к активированному протеину С (РАПС). Ее обнаруживают у 40% всех больных тромбофилией.

Чаще всего такое нарушение, приводящее к неконтролируемой коагуляции, – результат дефекта V-го фактора вследствие генетических аномалий. Из них чаще всего встречается мутация Лейдена, которая может быть гетеро- или гомозиготной. В случае гетерозиготной мутации Лейдена риск тромбоза повышается в 5-10 раз, в случае гомозиготной мутации – в 80 раз.

Мутация Лейдена - наиболее распространенный в европейской популяции протромботический дефект. Частота его гетерозиготного наследования среди европейцев колеблется от 3 до 16%. Гомозиготный вариант мутации встречается только у одного из тысячи (в 0,1%).

Раз уж я упомянул факторы свертывания. Их определение безусловно важно! Во-первых, для диагностики тромбофилии. Повышенное содержание факторов свертывания можно сравнить с массой снега, лежащего на крыше, и который рано или поздно свалится на стоящего внизу человека.

Известно, например, что повышение активности VIII-го фактора свертывания в 1,5 раза по сравнению со средним для популяции сопровождается 5-кратным риском развития тромбоза. Сниженное содержание факторов свертывания, напротив, может стать причиной геморрагического синдрома. Для этого изолированный дефицит одного фактора свертывания должен быть достаточно глубоким, со снижением активности ниже 10%. Однако, если дефицит касается не одного, а нескольких факторов одновременно, то для развития гемофилии достаточно снижения активности до 25-40%. Также имеет значение объем оперативного вмешательства: чем он больше, тем меньший дефицит прокоагулянтного потенциала станет критическим.

Как известно, задачей протеина С является инактивация V-го и VIII-го факторов свертывания. При чрезмерной активности этих факторов или сниженном содержании протеинов С и S, антикоагулянтной «емкости» протеина С может не хватать. В результате развивается РАПС, обусловленная не генетической аномалией. Такое встречается часто и об этом следует помнить.

Еще одно обстоятельство, о котором нужно знать – это влияние фактора Виллебранда на активность VIII-го фактора свертывания. Одна из функций фактора Виллебранда – защита VIII-го фактора от инактивации протеином С. В норме практически все молекулы VIII-го фактора связаны с фактором Виллебранда. Поэтому изменение содержания фактора Виллебранда всегда отражается на содержании в крови VIII-го фактора свертывания. Именно из-за VIII-го фактора 1,5-кратное повышение содержания фактора Виллебранда сопровождается 2-кратным увеличением риска тромбозов.

Раз уж я заговорил о факторе Виллебранда: болезнь Виллебранда – это самое распространенное геморрагическое заболевание. Дефектный ген фактора Виллебранда встречается 1:100 в популяции, из которых у каждого третьего имеются клинические проявления.

Встречаясь с повышенным содержанием VIII-го и V-го факторов свертывания, фактора Виллебранда, резистентностью к активированному протеину С – помните об их взаимосвязях.

Дефицит XII-го фактора свертывания, наоборот, может приводить не к повышенному риску кровотечений, а к риску тромбозов (болезнь Хагемана). Это обусловлено тем, что XII-й фактор – основной активатор фибринолитической системы. Вклад XII-го фактора в активацию фибринолиза намного больше, чем в свертывание крови.

В целом как протромботическое, так и геморрагическое влияние факторов свертывания нужно расценивать по суммарному изменению их активности.

Исследование фибринолитической системы

Для понимания гемостатического баланса важно знать и состояние фибринолитической системы крови. Снижение ее активности – фактор риска тромбозов, а повышение способствует развитию кровотечений. Какое изменение считать клинически важным? В 4-5 раз относительно средних популяционных значений.

Фибринолитическая система устроена сложно и определение ее отдельных компонентов может быть дорогостоящим и длительным. Для интегральной оценки целесообразно определять время XIIа-зависимого лизиса эуглобулинов (XIIа-зависимый фибринолиз) Эту методику многие считают устаревшей, но по простоте и доступности ей до сих пор нет адекватной замены. Она включена в Национальное руководство по лабораторной диагностике и в Приказ МЗ РФ №804н.

При исследовании фибринолитической системы важно понимать, что привело к снижению или повышению ее активности. О роли XII-го фактора свертывания как активатора фибринолиза я говорил.

Важнейшими ингибиторами фибринолиза считаются ингибиторы активатора плазминогена 1-го и 2-го типа (PAI-1 и PAI-2).

PAI-1 синтезируется в эндотелиальных клетках. Это острофазовый белок. Поэтому на фоне выраженной воспалительной реакции активность фибринолиза может снижаться в несколько раз. Повышение продукции PAI-1 и PAI-2 происходит и при беременности. Подавление фибринолиза при беременности – основная причина сдвига гемостатического баланса и формирования предтромботического состояния.

Определение плазминогена, предшественника лизирующего фибрин фермента плазмина, или альфа-2-антиплазмина, подавляющего плазминовую активность, имеет меньшую ценность, чем исследование XIIа-зависимого фибринолиза.

D-димеры и РФМК. Маркеры АФС

Что еще исследуют? Это определение D-димеров и РФМК.

D-димеры образуются при разрушении фибрина – основного структурного компонента тромба – фибринолитической системой или фибринолитиками. Концентрация Д-димера, таким образом, отражает активность фибринолиза и количество лизируемого фибрина. Повышение Д-димера определяется не только при тромбозах, но и после операций, особенно при большом операционном поле. D-димеры долго циркулируют в крови и после острого тромбоза могут персистировать до нескольких недель. Поэтому большее диагностическое значение имеет отрицательный результат этого теста (D-димер в пределах нормы).

РФМК – это растворимый фибрин, то есть его мономеры и олигомерные нити, еще не сшитые XIII-м фактором свертывания в плотную, нерастворимую структуру. Концентрация РФМК, зависящая от превращения фибриногена в фибрин, характеризует тромбиновую активность крови. РФМК появляются, когда состояние гемостаза угрожает развитием тромбоза. В отличие от Д-димера технология определения РФМК менее точна. Эффективный способом повысить точность определения РФМК – это одновременная постановка нескольких исследований с одним образцом крови и расчетом среднего значения.

Какие еще исследования важны? Это определение маркеров антифосфолипидного синдрома – важной причины тромбофилии. АФС на порядок повышает риск возникновения тромбоза. У женщин АФС встречается в 10 раз чаще, чем у мужчин. Для диагностики АФС клинические рекомендации предполагают определение волчаночного антикоагулянта (ВА), антител к кардиолипину и антител к бета-2-гликопротеину. Значение имеет только многократное повышение антифосфолипидных антител, причем подтвержденное спустя 12 недель. Незначительное повышение не рассматривается как диагностический критерий АФС.

Исследование сосудисто-тромбоцитарного гемостаза

Отдельным направлением является исследование сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Для этого необходимо исследовать тромбоциты в условиях, максимально близких к физиологическим.

Первое направление исследований - оптическая агрегатометрия. Для этого из венозной крови пациента центрифугированием получают богатую тромбоцитами плазму крови. К этой плазме поочередно в разных концентрациях добавляются индукторы, которые активируют тромбоциты и запускают процесс их агрегации.

Затем происходит запись агрегатограммы – графика, иллюстрирующего динамику формирования тромбоцитарных агрегатов. Диагностическое значение имеет задержка развития агрегации, скорость ее развития, амплитуда агрегации, скорость и амплитуда дезагрегации и характер агрегатограммы (одноволновая / двухволновая, обратимая / частично обратимая / необратимая). Все эти параметры зависят от концентрации индуктора.

Упрощенное исследование тромбоцитарной агрегации лишает врача важной диагностической информации. Как это может происходить?

Например, вместо записи агрегатограммы может фиксироваться лишь одно цифровое значение, отражающее интенсивность агрегации в какой-то момент, по сути характеризуя только одну точку на агрегатограмме. К этому же приводит использование какой-то одной концентрации индуктора или одного «универсального» индуктора.

Такой подход лишает врача 3/4 информации, которую можно получить и которая нужна для оценки риска тромбоза, нарушения сосудистой микроциркуляции и дозировки антиагрегантов.

Разновидностью оптической агрегатометрии является исследование спонтанной агрегации тромбоцитов без химической активации. Используется только механическая активация, имитирующая нарушение нормального кровотока. Такое исследование важно, поскольку нарушение ламинарной гемодинамики, турбуленция в токе крови – важный фактор активации тромбоцитов. Но оно не заменяет использование индукторов, которые в организме служат основным механизмом активации тромбоцитов.  

Второй метод исследования, еще более приближенный к физиологическим условиям – потоковая (проточная) динамическая агрегатометрия.

Для нее используется не плазма, а цельная кровь. Кровь пропускается через специальный картридж, в котором есть микроскопическое отверстие. На это отверстие, имитирующее просвет сосуда или участок его повреждения, нанесены индукторы агрегации.

В ходе исследования определяется время окклюзии, развивающейся за счет постепенного накопления в отверстии тромбоцитарных агрегатов, что ведет к уменьшению его просвета. В результате скорость протекания крови постепенно снижается вплоть до полной остановки потока. Изменение скорости потока, объем прошедшей через отверстие крови, время окончательной окклюзии с учетом типа индуктора и концентрации тромбоцитов имеют диагностическое значение.

Третий метод исследования - импедансная агрегатометрия. Она основана на измерении электрического сопротивления при скоплении тромбоцитарных агрегатов на электродах, погруженных в исследуемую кровь. Инициируется агрегация также добавлением различных индукторов.

По чувствительности этот метод значительно уступает оптической агрегатометрии и не обеспечивает того же приближения к физиологическим условиям, которое достижимо с использованием проточной технологии (динамической потоковой агрегатометрии).

Исходя из собственного опыта работы, мы пришли к выводу, что для получения максимума диагностической информации оптимально сочетание оптической и проточной агрегатометрии.

Интегральные (глобальные) исследования

Теперь перейдем к уже упоминавшимся интегральным исследованиям. Их три: это исследование тромбодинамики, тромбоэластография и тест генерации тромбина.

Исследование тромбодинамики - это российская разработка. Для исследования тромбодинамики из крови пациента центрифугированием получают бедную тромбоцитами плазму.

Плазма вносится в специальную измерительную кювету, размещенную в приборе – регистраторе тромбодинамики. 

В измерительную кювету вводится вставка, покрытая активатором свертывания – тканевым фактором. Она имитирует участок повреждения сосуда, в области которого плазма крови контактирует со структурами сосудистой стенки, также содержащими тканевый фактор. Как только вставка-активатор оказывается в измерительной кювете, запускается процесс свертывания, при котором на поверхности вставки постепенно образуется фибриновый сгусток.

Анализатор тромбодинамики с помощью фото- и видеофиксации регистрирует рост фибринового сгустка. Параметры роста имеют диагностическое значение и для них определены референсные интервалы, соответствующие состоянию нормы.

Видеозапись теста, помимо его визуализации, помогает выявить аналитические ошибки и оценить нарушения гемостаза. Основные преимущества метода - наглядность, простота, быстрота восприятия и легкость понимания результатов. Исследование тромбодинамики включено в Приказ МЗ РФ №804н под названием «динамическая тромбофотометрия».

Старейшим из интегральных методов исследования гемостаза считается тромбоэластография.

Тромбоэластограф измеряет вязкостно-эластические свойства формирующегося кровяного сгустка. Для этого в измерительную кювету последовательно вносятся активирующие свертывание реактивы и исследуемая кровь. Затем в кювету погружают вращающийся цилиндр. Когда в кювете начинается свертывание крови и образуются нити фибрина, возникает сопротивление вращению цилиндра. По мере формирования, полимеризации и уплотнения сгустка крови сопротивление вращению цилиндра увеличивается. Вращательное движение преобразуется в электрический сигнал, который обрабатывается прибором. Таким образом измеряется время образования первых нитей фибрина, время формирования стабильного сгустка, механическая прочность сгустка и процесс его постепенного растворения.

И, наконец, тест генерации тромбина. Способность генерировать тромбин определяет коагуляционный потенциал крови и может быть интегральным показателем состояния гемостаза. Метод основан на инкубации исследуемой крови с активатором и флюорогенным субстратом. Интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации образующегося тромбина. 

Плюсы и минусы различных методов исследования

Сравним интегральные исследования между собой и с другими методами исследования гемостаза.

По сравнению со стандартной коагулограммой, исходно предназначенной для обнаружения склонности к кровотечениям и малочувствительной к гиперкоагуляции, исследование тромбодинамики и тромбоэластография обладают равной чувствительностью к гипо-и гиперкоагуляционным состояниям. Кроме того, дефицит или избыток отдельных компонентов не позволяет судить об итоговой интенсивности свертывания крови и фибринолиза.

Определение D-димеров, появляющихся уже после образования фибрина или состоявшегося тромбоза, в отличие от интегральных исследований, ничего не говорит о предрасположенности к тромбообразованию, что нужно для его своевременного предотвращения.

Наконец, изменения в содержании отдельных компонентов могут быть разнонаправленными, затрудняя понимание происходящего и итогового результата.

В сравнении с тромбоэластографией тромбодинамика отличается намного большей чувствительностью. Основные недостатки тромбоэластографии – это широкие диапазоны норм, на фоне которых не всегда видны патологические изменения, и недостаточная разделяемость вкладов в процесс свертывания плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза.

Еще одно преимущество тромбодинамики перед всеми другими методами исследования гемостаза – это моделирование локального запуска свертывания крови, что имитирует образование тромба в области поврежденной сосудистой стенки. С другой стороны, использование в тесте тромбодинамики бедной тромбоцитами плазмы исключает возможность оценки этим методом тромбоцитарного звена гемостаза. Также исследование тромбодинамики не позволяет оценить состояние фибринолитической системы крови.

Основной недостаток теста генерации тромбина - его высокая стоимость, отсутствие стандартизации и общепризнанных референсных интервалов нормальных значений. По этим причинам ТГТ до сих пор относится к научным, а не клиническим лабораторным исследованиям. В нашей стране он практически нигде не выполняется. Это делает тромбодинамику и тромбоэластографию единственными доступными интегральными методами исследований.

Главный недостаток всех интегральных тестов в том, что они не дают информации об отдельных компонентах системы гемостаза. Наглядность результата исследования и простота для понимания оборачиваются упущенной информацией о деталях. 

В заключение

Я рассказал далеко не обо всех методах исследований гемостаза. В заключение хочу обратить ваше внимание на желательность его углубленного исследования даже в простых клинических ситуациях.

Очень часто причиной тромбофилии или геморрагического синдрома становится недостаток или избыток только одного компонента или сбой в одном регуляторном звене. Обнаружить такое изолированное нарушение возможно лишь при расширенном обследовании.

Каждый пациент, страдающий нарушениями в свертывающей системы крови, очень индивидуален. Это исключает шаблонный, опирающийся только на неоспоримую доказательную базу, основанный на технологической доступности и финансовой экономии подход к диагностике нарушений гемостаза. К сожалению, именно он лежит в основе большинства современных клинических рекомендаций и медико-экономических стандартов.

Однако, как показывает опыт, эффективная превентивная диагностика нарушений гемостаза возможна только при углубленном и всестороннем его исследовании.